Ultrasound-assisted extraction of inulin from elecampane

1. XII Национална конференция с международно участие
"Природни науки 2014" (NCNS2014)
Автори: Надежда Петкова, Манол Огнянов,
Мина Тодорова, Пантелей Денев
Катедра “Органична химия“
Университет по хранителни технологии - Пловдив
Ултразвукова екстракция и
характеристика на инулин от
корени на бял оман (Inula
helenium L.)

2. Inula helenium L. (бял оман)
 Лечебно растение от сем. Сложноцветни
 Централна и Южна Европа, Северна
Америка, Азия
 Североизточна и Източна България, Стара
планина – до 800 м надморска височина
 Действа спазмолитично, антисептично,
диуретично, противокашлечно и
предпазва от развитие на ракови клетки.
 Инулин – 11 - 45 %
 Използваема част – корените
 Количеството на инулина се влияе от
природо-климатичните условия

3. Обща характеристика на инулин
• Фруктан
• Инулинът е полидисперсен
растителен полизахарид, чиято
верига е изградена основно от
• β-фруктофуранозидни звена,
свързани (2→1), като много често
в единия си край сe съдържа α-
глюкопиранозен остатък свързан
(1→2).
• Степен на полимеризация (DP) - 2
до 70
• Бяло прахообразно вещество, без
мирис и страничен аромат, с
неутрален вкус
• Фруктоолигозахариди – инулини с
DP от 2 до 12
O
H
HO
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
H2C
CH2OH
HO
OH
O
CH2OH
CH2OH
HO
HO
O
n
O
GFn
O
H
HO
H
HO
H
O
OHH
H
OH
CH2
CH2OH
HO
OH
O
CH2OH
CH2OH
HO
OH
O
n
O
Fm
CH2

4. “I give this name to a new
vegetable principle, lately
discovered by Rose in the root of
inula helenium (elecampane)”.
Th. Thomson, 1818
В литерарурата терминът инулин е използван за пръв
път от Thomson през 1818 г., за да се наименува
веществото, което през 1804 г. германският учен Rose
изолира чрез екстракция с гореща вода от растението
бял оман (Inula helenium).

5. Източници на инулин и олигофруктози

6. Методи за екстракция и анализ на
инулин
- Екстракция с гореща вода
- Класическа екстракция
- Екстракция чрез прилагане на
ултразвук
- Микровълнова екстракция
Методи за анализ:
- спектрофотометрично
- HPLC
- IR – спектроскопия
- NMR

7. Здравословен ефект
• Диетични фибри
• Пребиотик
• Нискокалоричен
• Имуностимулатор
• Спомага абсорбцията на Са
и Мg
• Понижава нивото на
инсулина, триглициридите
в кръвта и кръвната захар

8. Приложение на инулин
• Заместител на мазнини в храните:
- кисело мляко
- сирена за мазане
- сосове
- замразени млечни десерти
- месни продукти
- сирена с намалено съдържание на
мазнини
• Замества захарта – шоколади
• В тестени и сладкарски изделия,
екструдирани храни
• Източник на разтворими фибри
• Стабилизатор на пени
• Структуро-определящ компонент
• Има идеална разтворимост
• Подобрява вкуса

9. Цел
Целта на настоящото изследване е чрез
прилагане на ултразвуково въздействие
да се изолира полизахаридът инулин от
корени на лечебното растение бял оман
(Inula helenium L.) и да се определят
основните му физикохимични
характеристики.

10. Сухи корени от бял оман
Смилане едрина на частиците 1 мм
Екстракция (трикратна)40 min, при 80 °С и yлтразвук 35 kHz
Филтруване (0.45 μm )
Филтрат
Алкализиране с 2 % Ca(OH)2 до pH 8
Престой 60 min при 25 °С
Филтруване
Пулпа от бял оман
дейонизирана вода (1:100)
Неутрализация с оксалова киселина
Пречистване с активен въглен
Филтруване
Филтрат
Утайка
Филтрат
Концентриране, охлаждане на екстракта до 2-5 °С
Утаяване с 95 % ЕtOH
Престой 12 часа при 4 °С
Центрофугиране (3000 rpm, 30 min)
Супернатанта
Утайка
Промиване с ацетон
Разтваряне в десилирана вода
Утаяване с 96 % етанол
Центрофугиране (3000 rpm, 30 min)
Лиофилизация
Утайка
Инулин от бял оман (чистота 95 %)
Утайка
Супернатанта
Промиване с 70 % ЕtOH
Метод 1

11. Сухи корени от бял оман
Смилане едрина на частиците 1 мм
Екстракция (трикратна)40 min, при 80 °С и yлтразвук 35 kHz
Филтруване (0.45 μm )
Филтрат
Алкализиране с NaOH до pH 7, охлждане
Пречистване през колона пълна с хитозан имобилизиран върху
носител силикагел
Пулпа от бял оман
дейонизирана вода (1:100)
Елуат
Утайка
Концентриране, охлаждане на екстракта до 2-5 °С
Утаяване с 95 % ЕtOH
Престой 12 часа при 4 °С
Центрофугиране (3000 rpm, 30 min)
Супернатанта
Утайка
Промиване с ацетон
Разтваряне в десилирана вода
Утаяване с 96 % етанол
Центрофугиране (3000 rpm, 30 min)
Лиофилизация
Утайка
Инулин от бял оман (чистота 93 %)
Супернатанта
Промиване с 70 % ЕtOH
Метод 2

12. Материали и методи
• Определяне точка на топене – на апарат
Кофлер
• Определяне на специфичния ъгъл на
оптично въртене - Automatuc digital
polarimeter РЗ001RS, KRÜSS (Germany),
при λ=589 nm.
• Определяне на редуциращите групи
(PAHBAH) – спектрофотометрично при
λ=410 nm.
• Определяне на белтъчно съдържание –
метод на Брадфорд.
• Определяне на DP и молекулната маса
на изолирания инулин.

13. Спектрофотометрично опредляне на инулин
Схема на реакцията на Селиванов
OH
CH2OHHOH2C
O
HO
OH
[ H+
]
-3xH2O
CHOHOH2C
O
[ H+]
-3xH2O
O
O
CH2OH
HO
O
OH
OH
2
фруктоза 5-HMF резорцинол
λ=480 nm
Ход на анализа:
- 100 μL проба (екстракт) 100 μL резорцинол (1 mg/cm3) 100 μL
тиоуреа (0,1 %), 800 μL EtOH (95 %) , 900 μL k.HCl (37 %)
Нагряване при 80 ºС за 8 min
Охлаждане, доливане до 10 cm3
Измерване на абсорбцията при 480 nm
тиокарбамид

14. Където:
• x – концентрацията на фруктоза, отгoваряща
от стандартната права, μg
• Vепр – обем на градуирана епруветка, 10 cm3
• Vk – обем на колбата, в която е събиран и
долят екстракта, cm3
• К1= коефициент за влага
• К2=0.91, коефициент на хидролиз на инулин
• P– масата на претеглената проба (изсушена), g
• 100 μL – обем на взетата проба (екстракт)

15. HPLC АНАЛИЗ НА ИНУЛИН ИЗОЛИРАН
ОТ БЯЛ ОМАН
Скорост на потока: 1 ml/min
Обем на инжектирана проба: 20 µL
Колона: Shodex® Sugar SP0810 с Pb2+
(300 mm x 8.0 mm, 5 μm)
Температура на колоната: 85 °C
Мобилна фаза:
дейонозирана вода
Детектор: RID-10A
Стандартна права за определяне на
инулин: Y=769884x+24074
R2=0.999

16. IR-FT СПЕКТРОСКОПИЯ
Апарат: Nicolet FT-IR Avatar Nicolet Termo Science spectrometer
IR-FT спектъра на изолираното вещество е регистриран в КBr таблетка в
диапазона от 4000-400 cm-1

17. Резултати
• Бяло прахообразно вещество с
жълтеникъв отенък, без мириз, с
неутрален вкус, разтворимо в
гореща вода
• Положителна реакция с реактив на
Селиванов – положителен тест за
кетози
• Фруктозно съдържание – над 89 %
• Чистота 95-97 %

18. Физико-химична характеристика на
изолираното вещество
mp, °C [𝛼] 𝐷
25 Белтъчно
съдържание,
%
Редуциращи
групи, %
DP Mm,
kDa
Инулин от
бял оман
(Метод 1)
178,5-
180
-24 1.0 2.9 33 5.3
Инулин от
бял оман
(Метод 2)
178-
180
-23 0.9 3.1 30 4.9
Търговски
инулин от
цикория
176 -33 0.2 2.8 22 3.6
Таблица 1 Физико-химична характеристика на изолираното вещество

19. HPLC-RID анализ на инулин
Mobile phase: deionized water
Column: Sugar SP0810 with Pb2+
(300 mm x 8.0 mm, 5 μm)
Column temperature: 85 °C
Flow rate: 1 ml/min
Injection volume: 20 µL
Detector: RID- 10A
O
H
HO
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
H2C
CH2OH
HO
OH
O
CH2OH
CH2OH
HO
HO
O
n
O

20. IR-FT спектър на изолирания полизахарид
ν(OH)
3330 cm-1
β 2→1 -гликозидна
връзка
817, 874, 933 cm-1
ν(С–С) 1170 cm−1
ν(С–О) 1087 cm−1
ν(С–О–С) 1030 cm−1
νC-H
as (CH2)
2931 cm-1
νC-H
s(CH2)
2880 cm-1
05001000150020002500300035004000
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
Wavenumbers [1/cm]
Transmittance

21. Таблица 2. Отнасяне на характеристичните ивици от IR-FT спектъра на
изолирания полизахарид от Inula helenium L.
Интервал на
характеристичните
честоти cm-1*ч
Експериментални
честоти, cm-1
Отнасяне
3200-3400 3382 νО-Н(ОН); ir H
-връзки
2933-2981 2929 νC-H
as(CH2)
2850-2904 2088 νC-H
s(CH2)
1664-1634 1647 Абсорбция н вода
1416-1430 1456 δC-H
s (CH2)
1335-1336 1338 βо-н (ОН)
1225-1235 1220 βо-н (ОН)
1125-1162 1141 νC-O-C
as (C-O-C)
1015-1060 1029 νC-O (C-O)
985-996 985 νC-O (C-O)
930 933 α-D-Glcp остатък във
веригата
892-895
874
873 δ(C1-H), вибрация на
пръстена (2-кетофуранози )
817 817 2-кетози

22. Заключение
•Приложен е ултразвуков метод за изолиране на инулин
от корени на бял оман (Inula helenium L.), както и два
подхода за пречистване на получените екстракти –
действие с активен въглен и пропускане през колона с
хитозан-силикагелни частици. И при двата метода се
получава добър добив и висока чистота на целевия
продукт.
•Изолираният инулин се отличава с висока степен на
полимеризация DP 30-33 и молекулна маса, което го
характеризира като дълговерижен и високомолекулен.
•Тези характеристики определя до голяма степен
неговите функционални свойства и последващо му
приложение като потенциален пребиотик,
имуномодулатор и текстуриращ агент в храните.

23. В чест на 110 години от рождението на Проф.
Стойко Стойков – основател на катедра
„Органична химия“ УХТ / към секцията
„Земеделска техника и технология“ към АУ
Пловдив (1948 г.)/