1. SPEKTROFOTOMETRİKSPEKTROFOTOMETRİK
YÖNTEMLERYÖNTEMLER
Doç.Dr. Emre SARANDÖLDoç.Dr. Emre SARANDÖL

2. Dersin AkışıDersin Akışı
Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı
Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli
Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar
Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri
Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması
ÖzetÖzet

3. Dersin AmacıDersin Amacı
Biyokimyanın temel ölçüm yöntemi olanBiyokimyanın temel ölçüm yöntemi olan
spektrofotometrik yöntemler hakkında bilgispektrofotometrik yöntemler hakkında bilgi
sahibi olmaktırsahibi olmaktır

4. Tıpta Biyokimyanın AmacıTıpta Biyokimyanın Amacı
Bir molekülünBir molekülün
Var olup olmadığınıVar olup olmadığını
(ne olduğu -işlevi)(ne olduğu -işlevi)
MiktarınıMiktarını
belirlemektirbelirlemektir

5. Tıpta temel araştırmalarTıpta temel araştırmalar
Sağlıklı durumun nasıl işlediğiSağlıklı durumun nasıl işlediği
Hastalıkların nasıl oluştuğuHastalıkların nasıl oluştuğu
Hastalıkların nasıl önlenebileceğiHastalıkların nasıl önlenebileceği
Hastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleriHastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleri

6. Tıpta günlük kullanımdaTıpta günlük kullanımda
Ayırıcı tanıAyırıcı tanı TANITANI
Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgiHastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi
Hastalığın seyrinin takibiHastalığın seyrinin takibi
Tedavi seçimini yönlendirirTedavi seçimini yönlendirir
Tedavinin etkili olup olmadığının takibiTedavinin etkili olup olmadığının takibi
Tedaviye ait yan etkilerin takibiTedaviye ait yan etkilerin takibi

7. Dersin AkışıDersin Akışı
Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı
Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli
Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar
Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri
Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması
ÖzetÖzet

8. Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli
Varlığı ya da miktarı araştırılan molekül ileVarlığı ya da miktarı araştırılan molekül ile
OLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİMEOLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİME
giren bir araç gereklidir !giren bir araç gereklidir !

10. İnternet bağlantılarıİnternet bağlantıları
http://www.youtube.com/watch?v=pCij70_nP-Ehttp://www.youtube.com/watch?v=pCij70_nP-E
http://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?
v=tY7oaspQqYQ&feature=relatedv=tY7oaspQqYQ&feature=related
http://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?
v=uqDWbknpiVk&NR=1v=uqDWbknpiVk&NR=1
http://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?
v=896vJj6eWYw&NR=1v=896vJj6eWYw&NR=1
http://youtube.com/watch?v=bDKyh1-V0nwhttp://youtube.com/watch?v=bDKyh1-V0nw
http://youtube.com/watch?v=NjpboerFt14http://youtube.com/watch?v=NjpboerFt14
http://youtube.com/watch?v=rxnDDfRfXEkhttp://youtube.com/watch?v=rxnDDfRfXEk
http://youtube.com/watch?v=4tiuRZk8TF4http://youtube.com/watch?v=4tiuRZk8TF4

11. Spektrofotometrik yöntemlerde bu araçSpektrofotometrik yöntemlerde bu araç
kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak içinkimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için
yöntemlere eklenen immunolojik veyayöntemlere eklenen immunolojik veya
enzimatik tepkimelerdirenzimatik tepkimelerdir

13. genelliklegenellikle
RenkliRenkli
BerrakBerrak
Çözeltiler elde ederizÇözeltiler elde ederiz

14. Dersin AkışıDersin Akışı
Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı
Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli
Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar
Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri
Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması
ÖzetÖzet

15. Elektromanyetik ışımaElektromanyetik ışıma,,
uzayda çok büyük hızla hareket eden biruzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerjienerji türüdürtürüdür

16. Elektromanyetik ışımanınElektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri,en çok karşılaşılan türleri,
gözle algıladığımızgözle algıladığımız görünür ışıkgörünür ışık ve ısı şeklindeve ısı şeklinde
algıladığımız infrared ışınlarıdıralgıladığımız infrared ışınlarıdır

17. Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki
elektromanyetik radyasyon enerjisidir.
Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki
genellikle nanometre (nm), bazen angström (Ao
) ve
milimikron (mµ) olarak ifade edilir.
Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık,
insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga
boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.

18. İnsan gözü, yaklaşık 380-750 nm arasında dalga boylarına sahip olan ışık
enerjilerine cevap verebilmektedir.
<380 nm dalga boyundaki ışık Ultraviyole (Mor-ötesi, U.V.)
380-440 nm dalga boyundaki ışık Menekşe
440-500 nm dalga boyundaki ışık Mavi
500-580 nm dalga boyundaki ışık Yeşil
580-600 nm dalga boyundaki ışık Sarı
600-620 nm dalga boyundaki ışık Turuncu
620-750 nm dalga boyundaki ışık Kırmızı
>750 nm dalga boyundaki ışık İnfraruj (Kırmızı-ötesi, IR) olarak
tanımlanır.

19. Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-
750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini
geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini
soğuruyorsa (absorpluyorsa) siyah görünür.
Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı
renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür.
yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı
rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür.

20. Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin
görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler
olarak adlandırılır.
Sarı-Mavi
Kırmızı-Yeşil

21. Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:
Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)
Yayılım (emisyon)Yayılım (emisyon)
Geçiş (transmittans)Geçiş (transmittans)
Tutulum (absorbans)Tutulum (absorbans)
Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)

22. ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ
Ölçülen ÖzellikÖlçülen Özellik Aletli Analiz YöntemiAletli Analiz Yöntemi
Işın AbsorpsiyonuIşın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisiSpektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi
Işın EmisyonuIşın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans,Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans,
Fosforesans ve Lüminesans SpektroskopisiFosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi
Işın SaçılmasıIşın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman SpektroskopisiTürbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi
Işın KırılmasıIşın Kırılması Refraktometri, interferometriRefraktometri, interferometri
Işın DifraksiyonuIşın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleriX-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri
Işın rotasyonuIşın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizmPolarimetri, dairesel dikroizm
Elektrik potansiyeliElektrik potansiyeli Potansiyometri, KronopotansiyometriPotansiyometri, Kronopotansiyometri
Elektrik yüküElektrik yükü KulometriKulometri
Elektrik akımıElektrik akımı Amperometri, PolarografiAmperometri, Polarografi
Elektriksel dirençElektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)
KütleKütle GravimetriGravimetri
Kütle/yükKütle/yük Kütle spektroskopisiKütle spektroskopisi
Tepkime HızıTepkime Hızı Kinetik yöntemlerKinetik yöntemler
Termal ÖzelliklerTermal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlikTermal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik
RadyoaktiviteRadyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleriNötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri

23. Lambert-Beer kanunu:Lambert-Beer kanunu:
Bir çözeltidenBir çözeltiden
geçen ışıkgeçen ışık miktarı,miktarı,
ışığın çözelti içindeışığın çözelti içinde
kat ettiği yol vekat ettiği yol ve
çözeltiçözelti
konsantrasyonu ilekonsantrasyonu ile
logaritmik olaraklogaritmik olarak
ters orantılı,ters orantılı,
emilen ışıkemilen ışık miktarımiktarı
ise doğru orantılıdırise doğru orantılıdır

24. İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UV-
görünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir
kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise
çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).

25. Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan
ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io)
daha küçüktür.

26. Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık
şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak
tanımlanır.
Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak
ifade edilir.

27. Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik
dansite, A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden
geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin
(soğurulduğunun) ifadesidir.

28. Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya
konsantrasyonu ile %Transmittans (%T) arasında
doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A)
arasında doğrusal bir ilişki vardır.

29. Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki
maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-
Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir
küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu
veya küvet çapının (l) artmasıyla azalır; ayrıca dilüe
çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu
(c) ile doğru orantılıdır. ε absorpsiyon katsayısı
(ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert-
Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur.

30. Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan
görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.
Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden
geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan
ışınlardır

31. GörünenGörünen
renkrenk
Absorbe edilenAbsorbe edilen
renkrenk
IşıkIşık λλ (nm)(nm)
-- -- 220-380220-380
Sarı-yeşilSarı-yeşil MenekşeMenekşe 380-440380-440
SarıSarı MaviMavi 440-475440-475
PortakalPortakal Yeşil-maviYeşil-mavi 475-495475-495
KırmızıKırmızı Mavi-yeşilMavi-yeşil 495-505495-505
MorMor YeşilYeşil 505-555505-555
MenekşeMenekşe Sarı-yeşilSarı-yeşil 555-575555-575
MaviMavi SarıSarı 575-600575-600
Yeşil-maviYeşil-mavi PortakalPortakal 600-620600-620
Mavi-yeşilMavi-yeşil KırmızıKırmızı 620-700620-700

32. Dersin AkışıDersin Akışı
Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı
Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli
Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar
Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri
Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması
ÖzetÖzet

34. Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya
çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme
işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da
fotometre denir.
Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu
da ölçülebilir.

35. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran
ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken,
yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler
spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

36. Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir
standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans,
optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin
absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.

37. Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin
kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin
kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli
sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı
dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda)
ışık seçilir.

38. İnternetteki sayfalarİnternetteki sayfalar
http://web.umr.edu/~gbert/color/AAcolor.html
http://pharmlabs.unc.edu/spectrophotometry/text.htmhttp://pharmlabs.unc.edu/spectrophotometry/text.htm
http://services.juniata.edu/ScienceInMotion/chem/spec-2.htmhttp://services.juniata.edu/ScienceInMotion/chem/spec-2.htm
http://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.htmlhttp://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.html
http://www.astronomynotes.com/light/chindex.htm
http://www.biology.lsu.edu/introbio/tutorial/Spec/spectrophotometry.html#anchor476241
http://www.umd.umich.edu/casl/natsci/slc/spec21.swf
http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/DB.mov
http://bioweb.wku.edu/courses/biol121/Protein/Graph_example.htm
http://courses.chem.psu.edu/chem36/UVVIS/index.htm

42. ÖzetÖzet
Miktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğinceMiktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğince
ÖZGÜN ETKİLEŞİMÖZGÜN ETKİLEŞİM
Emilen (absorbe olan) ışık miktarıEmilen (absorbe olan) ışık miktarı
konsantrasyonla doğru orantılıdırkonsantrasyonla doğru orantılıdır