la PCR comme outil en biologie moléculaire . PCR : Déroulement, optimisation, limites , inconvénients et variantes. PCR en temps réel et chimies de détéction PCR quantitative

1. Polymerase Chain
Réaction
Terranti .N
Encadrée par: Dr.Sifi
Laboratoire de biologie moléculaire
Service de biochimie clinique
CHUC
1
Avril 2013

2. Plan
Introduction
I- Méthodes d’amplification genique
I-1-L’ amplification par PCR Classique.
1-1 PCR : Définition ,Historique
1-2-Déroulement de la réaction.
1-3-Optimisation de la PCR
1-3-1-l’enzyme : polymerase thermostable.
1-3-2-Amorces : sens et anti sens
1-3-3 -Gamme de MgCl2
1-3-4-Température de fusion
1-3-5-Exemples d’amorçages illégitimes.

3. I-3-6-Agents chimiques.
I-3-7- hot start PCR
I-3-8-touch down PCR.
I-3-9-Contrôles de la PCR : positif /negatif
1-4 -Limites de la PCR
1-5-Inconvénients :
1-5-1- la contamination
1-5-2-la détection d’inhibiteurs.
1-5-3-Manque de fidélité de la Taq Polymerase.
1-5-4- Amplifications parasites .
1-6-Applications de la PCR.

4. 1-7 : Les variantes de la PCR : Principes et applications :
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèle spécifique PCR .
I-2 –PCR en Temps Réel :
Principe
Avantages
Chimies de détections
Appareillage
SYBR™ Green
Sondes TaqMan ™
Sondes TaqMan MBG ™
Sondes FRET ™
Molecular Beacon

5. I-3-La quantification : PCR QUANTITATIVE
En point final: quantification relative
quantification absolut
standard Externe
standard interne (pcr compétitive)
PCR semi quantitative: QMPSF
MLPA
En temps réel : Avantages
cycle seuil
Applications
Conclusion.
Documentation.

6. INTRODUCTION
• Biologie moléculaire : problème quantitatif .
• Techniques d’amplifications (progrès très
rapide dans le domaine de la biologie
moléculaire ces 20 dernières années)
• Répétition de réplications IN VITRO
• PCR : en moins de 3ans après sa description ,
tout les laboratoires de biologie moléculaire
l’utilisait .
6

7. AMPLIFICATION GENIQUE
Multiplication Exponentielle d’un
fragment d’ADN cible
grande quantité de fragments identiques
générés : aisément détectées +++ (sonde)
• pour obtenir un signal amplifié (faible
quantité de séquence d’ADN cible) on peut :
Amplifier l’ADN cible par PCR : 10⁹
copies
Nombreuses techniques de diagnostique
reposent sur cette amplification
Amplification de la
sonde
7

8. Amplification de cibles
PCR
- Amplification in vitro d’une petite quantité d’ ADN
cible
- le produit de l’amplification fera l’objet de tests
ultérieurs. (Post PCR)
- Méthode simple, rapide, sensible ,nécéssitant des
ingrédients simples et quelques heures de travail.
- Outil de base à différentes techniques de biologie
moleculaire.
8

9. PCR : HISTORIQUE
• 1983: Dr. Kary Mullis a developer la
PCR
• 1985: premiere publication de la technologie PCR
par la Cetus Corporation .
• 1993: Dr. Kary Mullis , Prix Nobel de chimie pour
avoir conçu la technologie PCR .
9

10. Polymérase Chain Réaction
• Chef de fil des méthodes d’amplification
géniques
PCR CLASSIQUE
spécificité/sensibilité
rapidité/possibilité de quantification
REAL TIME PCR« EN TEMPS »
10

11. PCR classique
• Basé sur la capacité de l’ADN polymérase à
synthétiser le brin complémentaire d’un ADN
servant de matrice .
• C’est est une succession de cycles, chaque cycle
contenant 3etapes :
1-Dénaturation
3-Elongation
2-Hybridation
11

12. Milieux réactionnel :
• dNTP
• Magnésium
• ADN polymérase
• Deux types d’amorces
On ajoute en suite l’ ADN extrait du milieu biologique à
étudier au mix :
12

13. 13

14. 1-Dénaturation thermique a 95 °C: (95°C > TM de
l’ADN) : rupture des liaisons hydrogènes et
séparation des deux brins d’ADN pour donner deux
ADN simple brins matrices .
2- l’hybridation des amorces : annealing : la
température du milieu est amené a une T° de (50
–65°) < Tm des amorces
3- Elongation : extension des amorces par la
TAqpolymerase à 72° , T° optimal pour l’extension
.
14

15. DENATURATION
93°C - 95°C
HYBRIDATION
50°C - 65°C
25-35 CYCLES
DENATURATION
93°C - 95°C
EXTENSION
72°C
15

16. 16

17. Déroulement de la réaction:

18. Réaction d’amplification en
chaîne par polymérase
(PCR)

19. Les acteurs
Séquence cible:ADN à amplifier
Amorces
•Taq polymérase
Pol

20. Premier cycle
Étape 1: dénaturation
Température:95°
Température:95°c
durée: 1 min

21. Hybridation
Séquence cible:ADN à amplifier

22. Étape 3: Polymérisation
Température:72°
Température:72°c
durée: 1 min

23. Polymérisation
Pol
Pol

24. Résultat:2 copies dont 0 copie
cible

25. Deuxième cycle

26. Dénaturation

27. Hybridation

28. Polymérisation
P
P
P
P

29. Résultat:4 copies dont 0 copie cible

30. Troisième cycle

31. Dénaturation

32. Hybridation
Polymérisation

33. Copie
cible

34. Résultat :8 copies dont 2
copies cibles

35. Quatrième cycle
16 copies dont 8 copies cibles

36. A chaque fois ,la quantité d’ADN double dans le
tube.
Une PCR de n cycles : 2ⁿ copies
20 cycles : 220=1 048 576 copies
30cycles : 230=1 073 741 824 copies
• Les brins long continuent leurs accumulation de
façon linéaire (ils ne sont générés qu’a partir de
l’extension des amorces sur l’ADN initial).
• Les brins court s’accumulent de façon
exponentielle (il seront très largement
majoritaire en fin de la PCR ).
36

37. 37

38. il est inutile d’augmenter le nombre de cycle, après 20
cycles l’amplification cesse d’être exponentielle et
atteint un plateau:
Dimerisation des amorces.
l’apparition des sous produits de réaction
ayant un pouvoir d’ inhibition (pyrophosphate)
L’épuisement et la dénaturation des
composants de la réaction et la compétition
entre les amorces et les fragments d’ADN
amplifié qui peuvent s’hybrider entre eux plutôt
qu’avec les amorces.
38

39. Eppendorf Mastercycler gradient
thermocycleur
39

40. Thermocycleur: automate assurant la variation de
température rapide entre des plateaux programmés ,
le nombre de fois requis .
EXEMPLE DE PROGRAMMATION DES CYCLES
Dénaturation initiale 5 min à 94˚C
Dénaturation;
93°C - 95°C
30 secs – 1min
Hybridation;
50°C - 65°C
30 secs – 1min
Extension;
70°-75°C
1min
X 25-35 cycles
Extension finale
2-10 min
40

41. 41

42. PCR Classique
• Il en ressort de cette technique que
la séquence à amplifier doit être
connue préalablement ( ou du
moins au minimum les séquences
d’hybridation des amorces )
42

43. PCR
OPTIMISATION
Composants de la réaction et leur influence sur
l’amplification :
l’enzyme: ADN
polymérase
thermostable
Température de
fusion
Agents chimiques
Les amorces sens
et anti sens
Magnésium :
MgCl2
43

44. OPTIMISATION
l’enzyme: ADN polymérase thermostable
Actuellement on utilise la taq polymérase
« eubactéries » extraite de bactérie (Thermus
aquiticus) vivant dans les sources chaudes.
T° optimale =72° (70-75°)
Capable de résister a de fortes T° ce qui a permis
l’automatisation de la procédure.
La quantité l’enzyme: 0,2-0,5… 1U (risque de
bandes parasites , si la quantité est importante )
Pas d’activité exonucléasique 3’ – 5’.
44

45. OPTIMISATION
l’enzyme: ADN polymérase thermostable
• la fidélité de l’activité enzymatique dépend de trois
caractéristiques spécifiques:
:
- la faculté de sélection des nucléotides.
- la discrimination entre les amorces correctement
ou incorrectement appariées.
- La présence d’une activité exonucléasique 3’-5’
associée , qui lui confère la capacité d’exciser un
nucléotide incorrectement apparié en 3’ d’une
amorce.
45

46. Taq
Pwo
Pfu
Tth
5’3’ exo
+
-
-
+
3’5’ exo
-
+
+
-
Vitesse:nt/sec 50
20-30
60
50
Longueur: Kb 3
3
3
3
Erreur: 106
26
32
Production
naturelle recombinant
naturelle
Source
Thermus Pyrococcus
aquatus archaebactériu
Pyrococcus Thermus
furiosus
thermophilus
30
recombinant
m
Demi vie
40 mn
120 mn
20 mn
M molaire
94 kDa 90 kDa
92 kDa
94 kDa
46

47. OPTIMISATION
Les amorces sens et anti sens
• Des logiciels permettent de définir rapidement des
amorces dans une séquence donné : Primer 3’ ( logiciel
libre disponible sur internet )
• http://simgene.com/Primer3
• Taille : 20 a 30 nucléotides
• Amorces : séquences exactement complémentaires du
fragment a amplifier .
• les séquences des deux amorces du même couple
doivent présenter le maximum de divergences et plus
particulièrement à l’extrémité 3’ , afin d’éviter leur
hybridation.
• Eviter la présence d’autocomplementarité : hybridation
de l’amorce sur elle-même .
47

48. OPTIMISATION
Les amorces sens et anti sens
• Composition en base; riche à 50 - 60% GC
les amorces devraient avoir des Tms équivalents (1°)
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C ) x 4 °C]
Formule aproximative , valable pour des amorces
inferieurs a 25 nucléotides.
- Evitez un T en 3’ ( mieux G ou C).
48

49. OPTIMISATION
Magnésium : MgCl2
valeur comprise entre 1.5 mM et 2 mM le Mg2+
influence l’activité de l’enzyme , augmente la
stabilisation du double brin et élève le Tm.
Pour optimiser une PCR il est nécessaire de faire
une gamme de MgCl2.
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4 mM
49

50. OPTIMISATION
Température de fusion
• Le Tm des amorces doit être suffisamment
élevée ( min 55° si possible)
• Plus le Tm est élevée , moins le risque
d’hybridation non spécifique des amorces est
important .
• Différence entre les Tm des deux amorces
doit être inferieur 5°
50

51. Exemples d’Amorçages illégitimes
51

52. OPTIMISATION
Agents chimiques
• Le DMSO (2-10%) (sulfoxyde diméthylique) aide
souvent l'amplification de fragments de + de 1kb.
• La formamide (1-5%) peut apparamment améliorer la
spécificité de la PCR , diminue les amplifications
parasites .
• Le glycérol (2-10%), améliore l'amplification des
échantillons (G+C) élevés et protège la Taq contre la
dégradation par la chaleur.
• Le polyéthylène glycol 6000 (5-15%) peut être un
additif utile quand la concentration de l’échantillon
d'ADN est très basse , ameliore l’efficacité
d’amplification.
52

53. OPTIMISATION
hot start PCR
• En PCR classique : les composants sont ajoutés a T° ambiante
(possibilités d’hybridations non spécifiques )
•
spécificité et sensibilité altérés .
• En hot start PCR :
par omission de réactif :
• un des composants du mix (MgCl2) n’est pas ajouté, une fois la
température est amenée a 80°C, ce dernier est ajouté .
paraffine solide qui se liquéfie a 70°C : éviter la réouverture
du tube (contamination +++) .
53

54. OPTIMISATION
hot start PCR
Taq polymérase encapsulé dans une bille de
paraffine. Ex :Taq Bed ™ Promega .
54

55. Taq polymérase active à72°C/inactive à T° ambiante
:le site actif de l’enzyme est bloqué par un anticorps anti
Taq polymérase . Elle ne devient active qu’après la
première étape de dénaturation . Ex : Fast Start Roche
55

56. OPTIMISATION
hot start PCR
Spécificité et sensibilité augmentées
56

57. OPTIMISATION
Touch down PCR
• Au début : T° d’hybridation élevée : il n’ya que les
appariements très spécifiques qui peuvent se
produirent . ( toute hybridation non spécifique au
début s’accroit de façon exponentielle )
• Avantages :- spécificité accrue +++
- permet de détourner les processus
d’optimisation compliqués de détermination des
T° d’hybridation optimales.
Intert : PCR d’un gene dont on ne connait pas la
sequence , mais dont le gene d’une espece proche
a deja ete etudié ( cible mal caractérisé)
57

58. OPTIMISATION
Touch down PCR
Principe:
démarrer la PCR a une T° d’hybridation supérieur à celle
calculée (Tm-5°C).
Diminution séquentielle pendant un certain nombre de
cycles , jusqu’à ce qu’on arrive a une température inferieur
au Tm des amorces .
EX: 94°C --------------- dénaturation .5 mn
94°C --------------- dénaturation 20 s
67°C --------------- hybridation 30s : 6 cycles (baisse de
2 ° /cycle) 55°C
72°C ----------------- extension 60 s
94°C --------------- dénaturation 20 s
55°C ---------------- hybridation 30 cycles
72°C ----------------- extension 60 s
58
72°C ----------------- extension 10 mn

59. Plus grande spécificité
No template control
-
-
( dilutions du contrôle positif)
Effect of touchdown PCR thermal cycling on non-specific amplification
59

60. OPTIMISATION
Touch down PCR
• Effect of touchdown PCR thermal cycling on
non-specific amplification :
Lane 1 : MW ladder.(echelle de taille )
Lanes 2–3 :negative control.
Lane 4 : no template control.
Lanes 5–12 : positive control dilutions.
The touchdown thermal cycling eliminates the
non-specific products in the negative control
reactions.
60

61. contrôles
• Pour chaque série de PCR il convient d’utiliser 1 contrôle
positif et plusieurs contrôles négatifs .
• le contrôle positif :
-ADN témoin connu .
- le nombre de copies (raisonnablement faible) :
contrôler la sensibilité de la méthode .
Ex: En infectiologie : une amplification négative( suspicion
d’ une inhibition de l’enzyme )
le contrôle interne : fragment d’ADN identique a la cible(
diffère par une partie de la séquence 20 Pb)
les mêmes amorces sont utilisées ( cible /contrôle interne)
le produit d’amplification sera analysé de manière
différentielle ( sondes spécifiques : extrait /contrôle
interne )
61

62. Contrôles
le contrôle positif
.
Contrôle interne
échantillon
+
-
-
-
+
+
Vrai négatif
?
Vrai positif
62

63. contrôles
Contrôle négatif :
Un tube qui contient tout les
éléments réactionnels sauf
l’ADN : s’assurer qu’il n’ya pas
de contamination
un tube contenant le mix réactionnel
+
ADN témoin non amplifiable par les
amorces choisis
Vérifier la spécificité de la réaction
L’évolution des techniques , l’apparition de la PCR en
temps réel et une certaine automatisation ont eu pour
effet de rendre ces mesures de contrôle moins
drastiques .
63

64. limites
A. La taille de la séquence a amplifié:
- elle ne doit pas être supérieur a 3Kb
B. le nombre de copie de la cible :
- des amplification à partir d’une seule copie est
réalisable mais très difficilement.
- lorsque le nombre de copie de départ est faible ,
effectuer deux PCR successives plutôt que de
multiplier le nombre de cycle
C-La PCR devient inefficace après 40-50 cycles (la
quantité du DNA ne change pas et atteint un
plateau.
64

65. INCONVENIENTS
.
Derrière une très grande simplicité , à la fois dans
le principe et dans la réalisation , se cachent de
nombreux pièges susceptibles d’entacher la
valeur des résultats obtenus.
L’utilisation de la PCR impose:
Une organisation particulière des laboratoires.
Une connaissance de tous les écueils.
Une grande expérience.
Chaque résultat doit être validé !!!!
65

66. INCONVENIENTS
• ?
LA
CONTAMINATION
La détection
d’inhibiteurs
Les amplifications
parasites
Manque de
fidélité de la Taq
Polymérase
66

67. INCONVENIENTS
LA CONTAMINATION
Premier risque majeur permanent de la PCR
• La contamination d’un tube ne contenant pas
la cible ( ADN/ARN) = résultats faussement
positifs .
- la source majeure est l’ADN amplifié au cours
des manipulation précédente surtout lors de
l’ouverture des tubes.
(projection dans l’atmosphère « aérosol »
=contamination du matériel).
67

68. INCONVENIENTS
LA CONTAMINATION
•
•
•
•
•
-
Précautions :
Aliquoter tout les réactifs en petits volumes .
Jeter tout réactif suspect .
Stériliser les tampons, les pointes de pipettes
Décontaminer le matériel par de l’eau de javel
Irradier aux UV la zone de travail pendant 15 minutes
Réaliser les incubations dans un laboratoire différent
de celui ou sera analyser le produit.
Ne pas recycler l'air de la post-PCR vers la pré-PCR .
(ADN amplifié en suspension dans l'air).
68

69. INCONVENIENTS
détection d’inhibiteurs
Second problème inhérent a la PCR .
• Risque de résultats faussement négatifs : en
particulier recherche qualitative de ( virus
/germes)
• Agents : -l’hème.
-DMSO (> 10 ℅)
- l’héparine .
-certains milieux biologiques : urines
/LCR : ( inhibiteurs de nature inconnus)
69

70. INCONVENIENTS
détection d’inhibiteurs
précautions :
1-Diluer l’échantillon (1/5) , (1/10) même plus
,dans de l’eau distillé stérile .
2-Chauffer l’échantillon 10 mn à 95°c
3-purifier l’ADN a nouveau .( risque accrue de
contamination lors d’extraction rapide )
4-Changer d’ADN polymérase : certaines sont
plus résistantes que la Taq polymérase : ex
:Tth polymerase .
70

71. INCONVENIENTS
Manque de fidélité de la Taq Polymerase
- les erreurs de réplication ne peuvent pas être
surmontées ,
elles peuvent engendrer des résultat erronés
lors de l’analyse des mutations sous clonage .
- pour minimiser : on détermine directement
les séquences avant clonage.
71

72. INCONVENIENTS
Les amplifications parasites
- c’est la possibilité que les amorces s’hybride a
un segment autre que la cible.
Par ↑ T°: progressivement jusqu’à ce que
les bandes contaminantes
disparaissent.
Le formamide a faible concentration (il
augmente la spécifié)
72

73. applications de la technologie PCR
Détection des mutations ponctuels :
se fait par hybridation des produits PCR
avec des sondes oligo-nucléotidiques
(technique du “DOT-BLOT“)
Maladies infectieuses : détection
d’ADN ou d’ARN viral
Neisseria gonorrhea
Chlamydia trachomatis
HIV-1
Introduction du produit PCR dans un
vecteur: clonage du produit PCR
Etude de l’expression des gènes
séquençage direct du produit PCR
Contamination de l’eau
DNA fingerprinting
Diagnostique de preinplantation :
fertilisation in vitro
Cancérologie : lorsque sous traitement ;
les cellules cancéreuses ne sont plus
détectables par les outils usuels .
La PCR détecte les mutation distinctes
présentes des ces cellules cancéreuses
73

74. Variantes de la PCR
•
•
•
•
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèle spécifique PCR .
74

75. Reverse transcription- PCR .
• PCR : amplification de fragments d’ADN
ARN --- reverse transcription ----- ADN c ---- PCR
L’ensemble des deux réaction : RT- PCR
Principe : une transcriptase inverse (ADN
polymérase ARN directed) transforme l’ARN
messager , viral, ribosomal en ADN. Celui-ci
pourra être amplifié par PCR.
La reverse transcriptase nécessite également la
présence d’amorces hybridés a la cible .
75

76. Reverse transcription- PCR .
• 1- amorces oligo dt: desoxythymidine
seulement, utilisés pour la RT-PCR d’ARN m
(toujours polyadenylé en 3’)
76

77. 77

78. Reverse transcription- PCR
• 2-Amorces hexanucléotidiques randomisées :
Mélange d’amorces très courtes ( 6 nucléotides
) comprenant toutes les séquences possibles
pouvant composer un hexanucléotides : 4⁶ =
4096 possibilités .
- grande certitude que des oligonucléotides
s’hybrideront a l’ARN pour servir d’amorce .
3- Amorces spécifiques .
78

79. 79

80. Reverse transcription- PCR
• Enzyme : Tth polymérase : Thermus thermo
philus polymérase : ADN polymérase
thermostable avec une activité reverse
transcriptase intrinsèque : (ARN 1kb )
Activité ADN polymérase
Activité exonucléasique 5’-3’
Pas d’activité 3’-5’ , Mg
Température optimale : 70 °C
Activité ADN polymérase
ARN directed ,
Mn( MnSo4)
Température optimale :
60 °C *
*60°C : déstabilisation de la structure secondaire des ARN ;
meilleur rendement et hybridation plus spécifique .
80

81. Reverse transcription- PCR
• Avantage : Tth Polymérase : un seul mix , diminution
du risque de contamination .
• Limites :lors de la contamination par de l’ADN
génomique ( une amplification préférentielle de l’ADN
est possible )
• Traiter l’ARN avec une Dnase.
• Emploie:
-détermination qualitative de l’expression d’un gène
ARNm.
-étude des rétrovirus ( HIV )
-suivie de cancer (RNA m unique)
81

82. Variantes de la PCR
•
•
•
•
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allele specific PCR .
82

83. Nested PCR .
• Principe: le produit issu d’une première PCR
est de nouveau amplifié a l’aide d’un second
couple d’amorces.
• Ce couple s’hybrident a une partie interne
(nested /nichée) de la séquence amplifiée .
83

84. 84

85. Nested PCR
• Sensibilité : considérablement augmentée
deux PCR successive sont réalisé.
Spécificité : accrue :
deux couples d’amorces sont
utilisés .
limites : risque de contamination considérable
( ouvrir le tube afin d’ajouter le deuxième
couple d’amorces)
85

86. 86

87. Variantes de la PCR
•
•
•
•
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allèle specific PCR .
87

88. PCR Multiplex
• Principe: amplification simultanée de plusieurs
séquences cibles (deux au moins) dans un même
tube d’amplification .
• Chaque amplification doit être indépendante:
( séquences cibles différentes / couples
d’amorces différents)
Les cibles doivent avoir une taille :
peu différentes (pour obtenir a peu prés la
même efficacité) mais suffisamment différentes
(pour qu’on puisse les distinguer sur un gel
d’agarose ,sauf si on réalise en post PCR une
hybridation avec des sondes spécifiques)
88

89. PCR Multiplex
Primerplex 2.0 : software pour le design
des amorces de PCR multiplex.
Usages :
-Plusieurs cibles peuvent être détectées
en même temps dans un seul tube :
trousse de détection de C.trachomatis
/N.gonorrhoeae
-Analyse des gènes de grande taille :
gène de la dystrophine2000Kb : 9 couples
d’amorces pour chercher des délétions .
Mise au point difficile .
89

90. 90

91. Variantes de la PCR
•
•
•
•
Reverse transcription PCR .
Nested PCR .
PCR Multiplex .
Allele specific PCR .
91

92. Allèle spécifique PCR
• Technique intéressante pour distinguer deux
allèles ne différant que par un, ou quelques
nucléotides:
-Etude d’un polymorphisme bi-allelique
-recherche d’une mutation.
• Principe:
un mésappariement en 3’ du complexe ADN cible
et amorce ralentie considérablement l’extension du
duplex. Cette propriété est mise a profit dans
cette technique.
92

93. Allèle spécifique PCR
93

94. P1- compatible- allèle 1
P2-compatible- allele2
P1--- mésappariement---allele2
P2---mésappariement---allele1
En absence de mésappariement l’allèle cible sera
amplifié.
En pratique: PCR sur 2 tubes : (P1/P3) et (P2/P3)
Sujet homozygote A/A
Sujet homozygote G/G
Sujet hétérozygote A/G
Tube P1/P3 : positif
Tube P2/P3 : négatif
Tube P1/P3 : négatif
Tube P2/P3 : positif
Tube P1/P3 : positif
Tube P2/P3 : positif
94

95. Allèle specific PCR
• la PCR spécifique d’allèle a été Supplanté par
la PCR en temps réel qui est devenu la
méthode de référence pour la discrimination
d’allèles et pour l’étude du polymorphisme .
95

96. PCR EN TEMPS REEL
Avant : la mise en évidence des mutations était
réalisé après la PCR classique .
Poste PCR : analyse des produits amplifiés
(électrophorèse, chromatographie….)
La PCR en temps réel permet de combiner :
PCR + analyse de produit amplifié
En une seule étape
!!!!
96

97. PCR EN TEMPS REEL
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Principe
Avantages
Chimies de détections
Appareillage
SYBR™ Green
Sondes TaqMan ™
Sondes TaqMan MBG ™
Sondes FRET ™
Molecular Beacon
97

98. PCR EN TEMPS REEL
Principe
Détection et quantification d’un signal
fluorescent émis par un fluorophore dont
l’intensité d’émission est proportionnelle a la
quantité de produit amplifié pendant la PCR.
PCR + Analyse ----- en une seule étape .
Permet le suivie en temps réel de toutes les
étapes de PCR .
98

99. PCR EN TEMPS REEL
Principe
99

100. PCR EN TEMPS REEL
Avantages
•
•
•
•
•
•
•
•
Grande sensibilité et spécificité .
Grande Capacité de multiplexage.
Rapidité d’amplification: 30 -60 mn (25-30cycles) .
Absence de manipulation en post PCR : risque de
contamination réduit (les tubes sont évacués et détruits
sans jamais avoir été ouverts: automates a system fermé )
Permet l’analyse qualitative et quantitative .
Analyse a haut débit .
Contrôle rapide des T°, excellente homogénéité de T° dans
et entre chaque tube.
Cout : > PCR classique ( gain de temps et de main-d'œuvre
considérable) ex : 2€ /3€ RT-PCR (dépend de la chimie)
100

101. PCR EN TEMPS REEL
Chimies de détections
• S’intercalent entre les deux hélices de l’ADN
double brin. SYBR™ Green
Agents
intercalant
Sondes
d’hybridation
• 1seule sonde linéaire marqué en 5’,3’ ou les
deux. Sondes TaqMan ™
• 2 sondes linéaires (1-5 pb) marqués: 5’,3’ ou les
deux Sondes FRET ™
• Structure tige boucle : balises moléculaires .
101

102. PCR EN TEMPS REEL
Chimies de détections
102

103. PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
• Différent par :
capacité d’échantillonnage.
durée des cycles.
capacité de détection des différentes
chimies .
thermocycleur
Compartiment de
détection de la
fluorescence
Traitement du
signal
103

104. PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
À grande capacité
À débit moyen
Analyse a grande échelle.
Ne sont pas compatible avec
toutes les chimies de détections
disponibles .
Capacité moyenne (32-96
échantillon par essai)
Flexibilité exceptionnelle
Light cycler 2.0® ( Roche diagnostics)
ABI Prism ® 7000,7700,7900
iCycler Iq ® ( BioRad)
Mx 4OOO®( Stratagene)
Certains Permettent la détection de
toutes les chimies actuellement
disponibles:
RotorGene® (Corbett Research)
Smart Cycler® (eurogentec)
104

105. PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
Light cycler 2.0® ( Roche diagnostics)
105

106. PCR EN TEMPS REEL
Appareillage
ABI Prism ® 7900
106

107. PCR EN TEMPS REEL
SYBR™ Green
• Agent intercalent, se lie a l’ADN double brin.
• Une fois liée , ↑ du signal fluorescent .
107

108. PCR EN TEMPS REEL
SYBR™ Green
Principe: au cours de l’hybridation et l’extension:
le SYBR Green s’intercale et émet une
fluorescence.
La fluorescence chute après la dénaturation du
cycle suivant
Acquisition de fluorescence une fois /cycle (7090°C) .
La quantité du signal suivie en PCR en temps réel
augmente proportionnellement au produit
amplifié formé (effet quantitatif)
108

109. PCR EN TEMPS REEL
SYBR™ Green
Avantages
inconvénients
-Moins toxique et plus sensible
-Ne différencie pas deux fragments de même
que le BET.
-Spectre de fluorescence
compatible avec les instruments
de détections utilisés.
-Economique / (sondes)
-Facilité de mise au point et
d’utilisation
taille (allèles-multiplex)
Possibilité de multiplexage reduite.
-Insensible a la présence de mismatch dans
le produit d’amplification : s’intercale sur les
produit d’amplification spécifiques , non
spécifiques et même sur les dimères
d’amorces = absence total de spécificité .
-Suppression de fluorescence non spécifique
en:
*réalisant l’acquisition du signal a une T°
supérieur au Tm des produits parasites .
*Optimiser le dessin d’amorces
*Faire une hot start
109

110. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
• Première chimie de PCR en temps réel , élaboré
par la société Perkin Elmer « Applied Biosystem »
pionnier dans le domaine de la PCR en temps réel
.
• Chimie basé sur : transfert d’énergie par résonance
: FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfert)
• Sondes très fréquemment utilisés.
110

111. PCR EN TEMPS REEL
REM
Sondes TaqMan ™
fluorophore
Etat initial
Onde
Electromagnétique
(ʎ: fonction du
ʎ
fulorophore- visible)
Si une substance est susceptible d’absorber la lumière
émise par un fluorophore est suffisamment proche (
quencher=extincteur) le REM émis est absorbé par le
quencher et aucune lumière n’est émise .
FRET : Fluorescence Résonance Energy Transfert
111

112. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
Sondes monobrin de 15 a 30
nucléotides , Complémentaire a la
partie centrale de la cible. Tm> Tm
amorces.
principe : activité 5’-3’ exo
nucléase de la Taq Polymérase .
Lors de l’élongation la Taq Pol
rencontre la sonde et la détruit (
nom Taq Man /analogie jeux
PacMan)
Fluorophore et quencher ne sont
plus a des distances ou le Transfert
d’énergie est possible .
Fluorophore excité--- émettre une
lumière ---- photomultiplicateur .
112

113. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
• La quantité de lumière émise
quantité de sonde détruite quantité
de produit de PCR synthétisé
113

114. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
Aspect de la fluorescence après amplification par PCR en temps réel Sondes TaqMan
5 échantillons , chacun représenté par une couleur distincte
114

115. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™
Avantages :
Sensibilité élevée
Grande spécificité ( SYBR Green)
Meilleur capacité de multiplexage ( cibles de mêmes taille « allèles » : fluorophore
différents
Rapidité
Inconvénients:
Difficulté de détection de certaines mutations localisées dans des régions de
séquences répétés (sondes a longues séquences )
Applications:
Mutations ponctuels
Polymorphisme biallelique
QUANTIFICATION : les plus utilisées apres SYBR Green pour la quantification de
gènes et d’agents pathogènes.
115

116. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™-MGB
• Sondes de 12-20 bases.
• 3’: quencher auquel est accroché une MGB (peut
s’insérer dans les petits sillons de la double
hélice formé par la sonde et la cible , stabilité+++ ͠
↑ Tm malgres des séquences plus courtes)
• Contraintes du design des sondes moins strictes.
116

117. PCR EN TEMPS REEL
Sondes TaqMan ™-MGB
Avantages :
Sensibilité est augmenté (quenching ↑)
Meilleur efficacité de détection des mutations dans les
régions a séquences répétés.
Applications:
Mutations ponctuelles
Polymorphisme bialleliques
Agents pathogènes ( bactéries , virus et parasites ….)
Quantification d’acides nucléiques ou d’ agents pathogènes
117
Cout extrêmement élevée , disponibilité Réduite .

118. PCR EN TEMPS REEL
Sondes FRET ™
118

119. PCR EN TEMPS REEL
Sondes FRET ™
• le système utilise un couple de sondes d’hybridation
très courtes portant chacune un fluorophore . La
particularité de ce système réside dans le fait que le
processus de transfert d’énergie par FRET s’effectue
entre deux fluorophores séparés par moins de cinq
nucléotides.
• Le transfert d’énergie est alors direct et hautement
efficace : une fois les deux sondes appariées à leur
séquence cible tout en restant adjacentes l’une envers
l’autre, l’énergie libérée par le fluorophore donneur de
haute énergie est directement captée par le
fluorophore accepteur de moindre énergie qui ainsi
excité émet à son tour un signal fluorescent
mesurable.
119

120. PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons
120

121. PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons
-Une sonde BeaconTM est une sonde d’hybridation en épingle à cheveux
qui porte à son extrémité 5’ un groupement fluorophore et à celle 3’ un
groupement fluorophore quencher .
Elle possède une structure particulière de type tige boucle dans laquelle
les bras de la tige résultent de l’appariement de ses extrémités
complémentaires ; la boucle est spécifique et complémentaire de la
séquence cible à détecter.
Dans ce type de sonde, la proximité des deux groupements
fluorophores est imposée par la structure secondaire en épingle à
cheveux de la sonde, ainsi dénommée sonde phare.
En présence de la séquence cible complémentaire, la sonde s’apparie
de façon spontanée à cette cible et subit un changement de
conformation au cours duquel le quencher s’éloigne du fluorophore
emetteur alors capable d’émettre une fluorescence mesurable
121

122. PCR EN TEMPS REEL
Molécular Beacons
Avantages :grande spécificité
les balises moléculaires demeurent intactes apres
PCR
Inconvénients: cout très élevée
difficulté du dessin optimal de la partie double
brin de l’amorce.
Applications : 1- détection des mutations ponctuels ou de
polymorphisme bi-allelique a grande échelle.
2-Quantification d’Acides nucléique et d’agents
pathogènes
122

123. PCR EN TEMPS REEL
Conclusion
• L’inconvénient des techniques basées sur le
FRET est qu’elles utilisent des Sondes difficile
à synthétiser . cout élevé +++ .
• Une autre possibilité plus économique est le
SYBR Green , celle-ci s’accompagne
néanmoins d’une perte de spécificité a
laquelle on peut remédier dans certaines
limites .
123

124. QUANTIFICATION
• Le developpement de la PCR à révolutionner
le domaine de la quantification des acides
nucléiques .
• Les techniques de quantification sont
appliqués a la biologie clinique ( étude de
l’expression d’un gène) mais surtout en
virologie ( détermination de la charge virale
en routine)
124

125. PCR quantitative
PCR quantitative
En point final
En temps réel
125

126. PCR quantitative
En point final
• Mise au point particulièrement complexe.
• Nombreuses stratégies décrites dans la
littératures ce qui reflète la difficulté d’obtenir
des résultats de quantification fiable par PCR
malgré une attrayante possibilité théorique !!
• L’évolution Exponentielle ( petite variation dans
le rendement/cycle →modification considérable
du nombre de copies obtenues en fin de réaction
.)
126

127. PCR quantitative
En point final
• Principe: exploitation de la cinétique de la
réaction PCR .
• Rendement :
n cycles : 2ⁿ copies exacte si le rendement était de
100℅
En pratique: X n = X˳ ( 1+ r ) , 0 ˳ R ˳ 1 .
• Une différence de 5℅ par cycle modifie d’un
facteur 3 le nombre de copies âpres 30 cycles.
• Effet plateau : due a la diminution du rendement
127

128. PCR quantitative
En point final
Quantité de produit formé
proportionnelle a la quantité d’ADN
de départ .
il n’ya plus de proportionnalité .
128

129. PCR quantitative
En point final
Quantification relative : compare 2
Quantification absolue
concentrations relatives d’acide nucléiques .
ADN: des PCR multiplex permettent
d’effectuer des dosages de gènes et
mettre en évidence un individu porteur
de délétion :
sujet N: locus N/ locus Analysé 2:2
sujet hétérozygote : 2:1 délété au
niveau du locus étudié.
ARN: analyse de l’expression des gènes .
ARN m
nécessite d’un standard interne
endogène ou exogène.
Détermination d’un titre exacte d’un acide
nucléique cible dans un échantillon .
Nécessite un standard titré.
Difficulté particulière de mise en œuvre
pour les ARN a cause des rendement
faibles et très variables des étapes de
transcription inverse .
129

130. PCR quantitative
En point final
Standard externe
-Solution titré d’ ADN de séquence identique à celle de la cible à quantifier
-Série de dilutions de raison 10 (4-5points) = gamme étalon .
-Déterminer le nombre de cycles idéale :
amplification efficace tout en restant en phase exponentielle .
-Chaque dilution ainsi que l’échantillon sont soumis a une PCR.
-Post PCR: quantification des produits formés par mesure de fluorescence.
(BET) ou colorimétrie.
-Avantages : rapide.
plusieurs échantillons en même temps
Inconvénients:
différence de rendement de PCR d’un tube a l’autre .
Nécessite un thermocycleur de qualité .
Possibilité de présence dun inhibiteur de la taqPoly dans le tube
patient .
( reproductibilité +- aléatoire)
Risque de variation du rendement d’un tube a l’autre
130

131. PCR quantitative
En point final
Standard Externe
131

132. PCR quantitative
En point final
Standard interne / PCR compétitive : palie au inconvénients précédents
Méthode de choix pour la quantification d’acides nucléiques par PCR .
Coamplification a l’aide des mêmes amorces dans le même tube de
l’échantillon à quantifier (ADN/ARN) et du standard
Le standard et la cible ne diffère que de quelques bases , pour que les
produits formés puissent être détectés ( électrophorèse) et quantifiés
séparément .
Dans ces conditions les facteurs susceptibles d’influencer la réaction
affectent d’une manière très similaire standard et cible .
Faire une dilution sérielle du standard.
X n = X˳ ( 1+ r )
Xn Y˳= X ˳ Yn
Y n = y˳ ( 1+ r )
Applications: Détermination de la charge virale (VIH –HCV) : élément
132
prédictif voir facteur de décision thérapeutique .

133. PCR quantitative
En point final
Standard Interne
133

134. PCR quantitative
En point final
• La PCR semi-quantitative est une PCR après laquelle (technique en
point final) la quantité de produit est quantifiée sur gel. En
parallèle, est effectué un témoin positif (standard) d’amplification
dont la quantité est inchangée dans les différentes conditions
comparées.
• En pratique: Réaliser un nombre limitant de cycles de PCR de façon
à se situer -au dernier cycle- dans la partie exponentielle de la
courbe d'amplification. C'est souvent la méthode utilisée pour
détecter des aneuploidies ou des délétions.
•
Cette méthode est parfois appelée PCR semi-quantitative car elle
ne permet pas de quantifier précisément un nombre de copies
initial d'ADN; cependant c'est une méthode très efficace pour
détecter un excès (duplication, trisomie) ou un défaut (délétion,
monosomie) de matériel génétique.
134

135. Recherche de délétions par QMPSF (Quantitative
Multiplex PCR of Short Fragments)
• Amplifier /PCR plusieurs exons du gène a tester (1seul
tube en multiplex)
• Chaque exon/couple d’amorces spécifiques et l’une
d’entre elles est marqué.
• Les conditions de la PCR sont quantitatives (cycle
limitant).
• Dans un premier tube : ADN du patient a tester .
• Dans un deuxième : ADN témoin qui ne porte pas de
délétion .
• On superpose les signaux de fluorescence:
témoin/patient
• Permet de détecter les grandes deletions a l’etat
hétérozygote .
135

136. Recherche de délétions par QMPSF
(Quantitative Multiplex PCR of Short
Fragments)
136

137. MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification)
• La Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification (MLPA) est une technique robuste
de quantification génique basée sur la ligation et
l’amplification d’oligonucléotides.
• Sa fiabilité et son efficacité ont été largement
éprouvées et ne sont aujourd’hui plus à
démontrer.
• Permet le détection de la variation du nombre de
copies d’un LOCUS ( trisomie 21 )
137

138. MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification
• Principe: ce n’est pas la sequence cible qui est
amplifié, mais la sonde MLPA hybridé à la
cible.
• 1 seule paire d’amorces est utilisé.
• Les produits d’amplifications sont analysé par
électrophorèse et comparé avec un temoin.
• Elle permet de savoir quelle séquence
présente un nombre aberrant de copies
138

139. MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification
139

140. PCR quantitative
En temps réel
• Les techniques en point final donnent des résultats
satisfaisants mais de mise en œuvre difficile.
• La quantification en temps réel présente de nombreux
avantages :
-sensibilité ,reproductibilité , grande souplesse, rapidité
-Quantification cinétique . En temps réel .
-Applicable à Analyse a grande échelle
-Automatisable ( analyse en routine)
-Excellente linéarité 10 à 10⁸ copies .
-Réalisation en tube fermé.
140

141. PCR quantitative
En temps réel
• On fait une dilution en série d’un plasmide contenant
le gène cible .
• Le déplacement horizontal : plus il ya de cibles
amplifiées , plus l’amplification se fait précocement .
• La quantité de cible est déduite de son cycle seuil
(threshhol cycle : temps necessaire pour que la
fluorescence atteigne une valeure seuil) en se
rapportant sur la courbe d’étalonnage.
• Les calculs sont habituellement réalisés par des
logiciels de quantification intégrés dans les appareils
de PCR en temps réel.
141

142. Cycle seuil
• Un seuil de fluorescence est établi par le
programme de la machine de PCR en temps réel.
Une fois que la quantité d'ADN permet aux
sondes fluorescentes de dépasser ce seuil alors
on obtient un numéro de cycle PCR appelé
"Ct"pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil.
• C'est cette valeur qui est à la base des calculs
pour quantifier l'ADN de façon absolue ou
relative
142

143. 143

144. PCR quantitative
En temps réel
• La quantification peut être :
Absolue .
Relative : le gène d’intérêt est exprimé par
rapport à un gène référence ou Housekeeping
gène ( std interne)
• les gènes de références les plus utilisés :
gène de la GA3PD
gène de la B actine
gène de la B2 microglobuline.
gène de l’albumine
144

145. PCR quantitative
Applications
1-Microbiologie:
• Détection de plusieurs pathogènes dans un même tube
(multiplexage/différentes chimies de détections)
• Bacteriologie:domaine ou la PCR en temps réel trouve la
meilleur indication :
-MEV des bactéries a culture lentes (Mycobacterium
tuberculosis,Bordetella pertusis, Legionelles Mycoplqsme…..)
-germes non cultivables
-recherche de meningite ( nécessité de détection rapide)
• Virologie:
HBV,HCV,CMV,VIH
détection des mutation de résistances aux antiviraux
145

146. PCR quantitative
Applications
• Domaine agro-alimentaire : détection des
germes : salmonelles, coliformes fécaux …..
• Oncologie
• Immunologie
• ……
146

147. CONCLUSION
• La PCR est probablement l'une des découvertes
scientifiques les plus importantes des dernieres
décennie. Grâce à cette technique, la biologie
moléculaire a accompli en 10 ans des progrès
sans précédents.
• D’autres techniques d’amplification on été
proposés , leur mise au point est complexe et
leur utilisation reste limité a des kits de
diagnostic commerciaux .
• Leur motivation est plus de contourner le brevet
de la PCR que d’augmenter les performances .
147

148. Documentation
• Principes de biologie moléculaire en biologie clinique
Marc Bogard, Jérôme Lamoril, Nedjma Ameziane
• Biologie moléculaire et médecine
Jean-Claude Kaplan, Marc Delpech
• Schouten JP et al. (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid
sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification Nucleic
Acids Res 30, e57.
• Aretz, S. et al. (2007). High proportion of large genomic deletions and a
genotype phenotype update in 80 unrelated families with juvenile
polyposis syndrome J Med Genet. 44, 702-709.
• Redeker, E.J., et al. (2008). Multiplex ligation-dependent probe
amplification (MLPA) enhances the molecular diagnosis of aniridia and
related disorders Mol Vis 14, 836-840.
• Laboratoire de Génétique Moléculaire Humaine et laboratoire SESEP
Equipe de l'EA2493, UFR de médecine Paris Ile de France Ouest
http://www.sesep.uvsq.fr/formation/methodes.html
148