Multipl Skleroz patogenezinin mitokondri açısından açıklanması.MS'li aksonlarda meydana gelen mitokondrial fonksiyon değişiklikleri ve bu değişimlerin nasıl tedavi hedefi haline gelebileceğini anlatan Oxford Brain Journal'dan makale çevirisi.

1. MULTİPL SKLEROZDA AKSON DAHİLİNDE
MİTOKONDRİAL DEĞİŞİKLİKLER
GİRİŞ
Multipl skleroz genç erişkinlerde nontravmatik
nörolojik bozukluğun en sık nedenidir;bununla
birlikte multipl sklerozda;akson
dejenerasyonunda enerji eksikliği sorumlu
tutulmuş olup,hastalık progresyonuyla
patolojik değişikler koreledir.
Demiyelinizasyonu ve sonraki değişen
ilerlemedeki kayıpları takiben; aksonların
demiyelinize kısımlarında,sodyum kanal sayısı
artışı olmak üzere biri değişiklik görülür.İntra
aksonal iyonik dengenin işlerliği ve sodyum
akımına bağlı;membran dinlenme
potansiyeli,artan sodyum kanalları üzerinden
,MSS’de enerjinin en büyük
tüketicisidir.Akson enerji tüketimindeki bu
artış;myelin basic proteini defektli shiverer
farelerinde yapılan deneysel
çalışmalarda;mitokondrial yoğınluk ve aktivite
artışının görülmesiyle anlaşılır.
Mitokondri;ATP’nin en etkili üreticisidir ve
apoptozda,reaktif oksijen radikalleri
sentezinde ,kalsiyum homeostazında rol
oynamaktadır.Muhtemel
inflamasyon,travma,iskemiyi içeren bir dizi
etki nedeniyle akson
dejenerasyonunda;intraaksonal kalsiyum
dengesizliği görülür.
Mitokondirial solunum zinciri;mitokondrial
membran içine lokalize olup compleks
I,II,III,IV ve doğrudan ATP sentezinden
sorumlu compleks V’den oluşur.Mitokondrial
solunum zincirinin su taşıyıcısı compleks IV-
veya sitokromoksidaz COX-%90 üzerinde
oksijenin suya dönüştüğü yerdir.
Konsantrasyonuna ve maruz kalma süresine
bağlı olarak,MS lezyonlarında olduğu gibi
complek IV NO hedefidir ve geri dönüşümsüz
inhibe olabilir.İnflamatuar
çevrelerde;mitokondiral solunum zincir
aktivitesi non-nükleler DNA-mitokondirial
DNA’ya zarar veren subunitlerin alımı ve
postranskripsyonel modifikasyonu etkileyen
reaktif oksijen radikallerine bağlı bozulmuş
olabilir.
Mitokondrinin tüketimi ve solunum
zincirindeki defekt,sadece enerji defisitinin
sebebi değildir;kalsiyum tutma kapasitesini
bozan sitotoksik hasarın aksonlardaki
hassaslığını artırabilir.
Artan kanıtlar multipl skleroz patogenezine
mitokondriyi yerleştiriyor.
-Mitokondrial solunum zincir kompleks I ve
III aktivitesi;mitokondrideki nükleer DNA
kodlu transkriptleri proteinlerin azaldığı non
lezyonel motor kortekste düşer.
-Compleks I aktivitesindeki düşüle ilişkili
olarak;kronik aktif beyaz cevher lezyonlarında
mitokondrial DNA için oksidatif hasar söz
konusudur.
-İlginç olarak;kompleks IV aktivitesi ve
mitokondrial DNA kopya sayısı,muhtemelen
kompansasyonla ilişkili olacak şekilde kronik
aktif lezyon homojenatlarında ve normal
görünümlü gri cevher nörönlarında artmıştır.
Alıntı yapılan çalışma,compleks IV aktivite
eksikliğinin kronik aktif lezyonlarda aksonal
dejenerasyonda major bir rol oynadığını öne
sürmektedir.
METOD
A)OTOPSİ DOKULARI VE
LEZYONLARIN KALSİFİKASYONLARI
9 MS vakasından;posterior frontal lobdan 6
makroskopik lezyon;5 MS vakasından servikal
ve /veya torasik spinal kordan 6 makroskopik
lezyon ,Luxol Fast Blue dağılımı ve kriostat
bölümlerinde proteolipidoprotein ve HLA-D
eksprasyonu boyanmasına bağlı ;daha önceki
prtokollere uygun olarak kronik aktif ve yavaş
ilerleyen kronik aktif lezyonları şeklinde
tanımlanmıştır.
MS vakaları için ölüm
sebebi;pnomoni(n=7),kardiak
yetersizlik(n=1),sepsis(n=2) ve kontrol grubu
için kardiyopulmoner arrest ve pnomoniydi.
B)İMMÜNOHİSTOKİMYA

2. Çift ve üçlü etiketleme immunflorasan
etiketleme için;anında dondurulmuş
bölümler,hidrojen peroksit olmadan
,immünohistokimya için olduğu gibi
hazırlanmış bir alt sınıfı belirli bir ikincil
antikorlar doğrudan florokromlar ile moleküler
prob kullanılarak konjuge edilmiştir.
Uygun kontroller,çapraz reaktivite ve çiftli-
üçlü etiketlenme deneylerinde spesifik
olmayan bağlanmayı dışlamak için
gerçekleştirilmiştir.
C)COX VE SDH HİSTOKİMYASI
Beyin ve spinal kord doku blokları ,belirili bir
kimyasal işlemden geçtikten sonra COX
ortamına inkübe edildi.İnkübasyon
sonrası,akson ve mitokondri çift
immünoflorans histokimya kullanılarak
tanımlandı.Compleks II aktivitesini tespit
etmek için SDH ortamına inkübe
edildi,sonrasında COX ortamı içinde 50 dakika
süreyle yıkandı.
COX histokimyasının tanımlanmasının
ardında ,aksonlardaki kompleks IV aktivitesini
tanımlamak için ;protokollere uygun olarak
nörofilament ve amiloid prekürsör proteine
karşı antikorlarla immunflorasan olarak
etiketlendi.
D)COX ELEKTRON MİKROSKOPİSİ
1 mm kalınlığında normal görünümlü beyaz
cevherden ve spinal kord lezyonlarından
disseke edilen doku örnekleri;CompleksIV
aktivitesini tespit etmek adına protokolüne
uygun belirli bir işlemden geçirilmiş ve Philips
CM 100 EM ile incelenmiştir.
E) WESTERN BLOTTİNG
Homojenatları hazırlamak için;CON’dan (n=6)
beyaz cevher,normal görünümlü beyaz cevher
(n=6) ve posterior frontal korteksten kronik
inaktif multipls skleroz lezyonları
(n=6);kriostatkesitlerinden 20 mm kalınlıkla,
dikkatlice;scalpel ve 250 mM sukroz,2mM
HEPES ve 0.1 mM EDTA katılmış
homojenize tampon kullanılarak çıkarıldı.
Homojenatlardaki proteinlerin elektrofonetik
olarak 4 derecede 0.45 mm poliviliden florür
membranlara dönüştürülmesinin ardından bir
dizi işlem sonrası ; B-actin,porin fosforile total
nöröfilament,sintafilin ve compleks II alt
birimine karşı primer antikorlarla inkübe
edildi.
Adından yapılan çözeltilerle yıkanma ve
inkübasyon işlemleri sonrası ECL plus
Western Blotting kullanılarak tespit edildi.
F)NÖRON KÜLTÜRÜ
Vahşi tip fare embrionik kök hücresi
çizgisinden farklılaşmış nöronları
kullanılıp,yapılan işlemlerle olgunlaştırılması
sonrası,;olgun nöronlar sodyum azid-spesifik
kompleks IV inhibitörü- ve glutamatın çeşitli
konstarasyonlarına tek veya birlikte maruz
bırakıldı;bu işlemlerle subletal sodyum azid ve
glutamat konsanrasyonu tespit edildi.
Böylelikle nöron kültürlerinin 10 mM sodyum
azid maruziyetinin compleks IV aktivitesini
%86 oranında düşürdüğü spektrofotometre
kullanılarak tespit edildi.
G)MİKROSKOPİ
Mitokondrial makrofaj yoğunluyla ilişkili
kompleks IV aktivite analizi için;COX
histokimyasal ve alan başına HLA
immünohistokimyasal boyanmaının dört
parlak alan gri ölçekli görüntüleri;seri
bölümlerinde 20 büyütme ile elde edildi.
Doku kesitlerinde akson dahilinde
mitokondrial kitele analizi için;porin ,sintafilin
ve aksonal markırlarla üçlü etiketlenmiş
kesitler;63 xoil lense ve Leicolaser scanning
mikroskop kullanılarak görüntülendi.
Nöron kültürlerinde aksonlar,B-tubulin
immunoflrasan etiketiyle tanımlandı ve 50 B-
tubulin pozitif akson SMI32 veya amiloid
prekürsör protein ile kapak silip başına,bitişik
olanlarda görüntülendi.
F)MİTOKONDRİAL KİTLENİN ve
AKSONAL KOMPLEKS IV’ün
KANTİTASYONU
Geniş aksonlardaki compleks IV aktif
bileşenlerini tanımlamak için
,SMI31,SMI32,APP immünoflorasan yoluyla

3. etiketlenmiş aksonların ana hattı,COX
histokimyanın parlak alan resminin üzerine
bindirildi ardından;dansiteometri ve Zeiss
Axio Vision sürüm 4.6 kullanılarak
yoğunlukla ilgili daha fazla analize tabi
tutuldu.Ek olarak,COX histokimyasal
ürünlerinin dansitometrik analizi;doku
kesitlerinde kompleks IV aktivitesinin
değerlendirilmesi için geçerli bir araçtır.
Mikroglial/makrofaj ile compleks IV
aktivitesinin (ters) korelasyonu için;COX
histokimyasal boyamanın tüm 20x gri ton
görüntülerinin dansitometrik değeri,normal
görünümlü beyaz cevherin değerine göre
belirlendi,;iç kontrol olarak lezyonun karşılık
gelen değerinden çıkarıldı.
G)İSTATİSK
SPPS version 14;demylenize ve mylenize
aksonlarda compleks IV aktivitesi ve porin
immün reaktivitesinin kıyaslanması için
kullanıldı.
SONUÇLAR
Alıntı yapılan çalışma;MS ve aksonal
dejenreasyonda ,mitokondrial defektin önemli
olduğu düşünülerek kronik aktif ve inaktif
lezyonlarda mitokondrial aktivite ve kitle
çalışılmıştır.
1)APP ve SMI32 İMMÜNREAKTİF
HASARLI DEMYLENİZE AKSONLARDA
COMPLEKS IV DEFEKTİ VARDIR.
APP pozitif aksonlardan compleks IV
aktivitesi; SMI31 pozitif myelinize ve
demyelinize kontrol grubu beyaz cevher ve
inaktif kronik lezyon aksonlarıyla
kıyaslandığında anlamlı şekilde düşüktür.
Ayrıca compleks IV aktivitesinde anlamlı
düşüklük;kronik lezyonların inaktif alanlarının
SMI32 pozitif kronik demyelinize alanlarında
;SMI31 pozitif kronik demyelinize aksonlara
kıyasla mevcuttu.
Porin reaktivitesine bağlı mitokondrial kitle
APP pozitif demyelinize aksonlarda
değişmemişken ,SMI32 reaktif kronik
demyelinize aksonlar mitokondrial aktivte için
önemli bir azalma ortaya koydular.
Bu bilgiler,APP pozitif demyelinize
aksonlarda kompleks IV defektiyle
tutarlıdır;oysa SMI 31 ile kıyasla SMI32
reaktif kronik demyelinize aksonlarda
compleks IV aktivite eksikliği,kısmen
mitokondrial tükenmeye bağlı görünmektedir.
2)MULTİPL SKLEROZ LEZYONLARININ
KRONİK İNAKTİF ALANLARINDA
MİTOKONDRİAL SOLUNUM ZİNCİR
KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ ARTMIŞTIR.
Sürpriz olacak şekilde;inaktif lezyonlarda ve
kronik aktif lezyonların inaktif merkezinde
özellikle mitokondrial solunum zincir
kompleks II ve IV’ün histokimyanının ortaya
koyduğu aktivitesi artmıştır.Mitokondrinin
tipik noktasal kompleks IV aktif
bileşenleri;normal görünümlü beyaz cevhere
kıyasla kronik demyelinize alanlarda dansite
ve intensite açısından daha belirgindir.Bununla
birlikte;normal görünümlü beyaz cevherin
myelinize aksonlarlakıyaslandığında;göreceli
inaktif kronik lezyonlardaki demyelinize
aksonlarda,COX elektron mikroskopisi
mitokondride büyük compleks IV aktivitesi
göstermiştir.
Compleks IV aktivitesinin %95 güven
aralığına dayanarak;kontrol grubu beyaz
cevherdeki myelinize aksonlarına
kıyasla;multipl sklerozlu beyin ve spinal
kordaki kronik demyelinze aksonların sırasıyla
%55 ve %59 artmış compleks IV aktivitesi
göstermiştir.
3)MS LEZOYNLARININ İNAKTİF
ALANLARINDAKİ MORFOLOJİK
OLARKA İNTAKT DEMYELİNİZE
AKSONLARINDA MİTOKONDRİAL
KİTLE,SİNTAFİLN VE FOSFORİLE
NÖROFİLAMENT ARTMIŞTIR
Alıntı yapılan çalışmada;tüm mitokondrilerin
dış membranı üzerinde eksprese olan voltaj
bağımlı anyon kanal ve porine karşı
monoklonal antikorlar ;histokimya,üçlü
etiketleme ve immunoflorasan ve Western Blot
kullanılarak akson dahilinde ve lezyonlarda
mitokondrial kitle belirlendi;sırasıyla sintafilin
a,mitokondrial yerleştirme protein ve SMI31
özellikle aksonlarda eksprese edildiği
görülmüştür.

4. Porin,sintafilin ve SMI31’in üçlü etiketlemesi
ve confocal mikroskopi;myelinli kısımlara
göre demyelinize aksonlarda mitokondrinin
bol miktarda olduğunu göstermiştir.
Mitokondri,özellikle nörofilament H’nin yan
kolları olmak üzere yüksek molekül ağırlıklı
nörofilament ile etkileşir;Nörofilamet H’nin
yan kollarının fosforilasyon
durumu,mitokondrinin metabolik aktivitesine
bağlı bir şekilde,nörofilament ve mitokondri
arasındaki etkileşimi etkiler.Alıntı yapılan
çalışmada,B-avtin için doğrulandığında
;kontrol grubu (1.86 kat 6 olguda p=0.02)
beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz
cevher(1.83 kat 6 olguda ile kıyaslandığında
fosforile nörofilament –H’de anlamlı artış
bulunmuştur ancak toplam nörofilament
miktarı kontrol grubu ve normal beyaz
cevherle kıyaslandığında anlamı fark
bulunmamıştır.Yani;fosforile ve tüm
nörofilament H arasındaki oran kontrol gurubu
beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz
cevhere kıyasla kronik lezyonlarda
fosforilasyon oranında anlamlı artış
tanımlandı.
4)KRONİK MS LEZYONLARINDA
KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ MİKROGLİA
VE MAROFAJ KONSANTRASYONUYLA
TERS ORANTILIDIR
Aksonal yaralanmanın inflmasyon ile ilişkili
olduğu gerçeğine
dayanarak;mikroglia/makrofajlar MS
lezyonlarında reaktif oksijen ürünlerinin
kayanağıdırlar ve compleks IV ROÜ aracılıklı
hasara hassastır.Alıntı yapılan çalışma ,kronik
lezyonun inaktif (n=22) ve aktif (n=8)
aksonlarında mikroglia ve makrofaj yoğunluğu
tespit edilmiş olup,bu yoğunluk seri kesitlerde
compleks IV akitivtesiyle ters korelasyon
göstermiştir.
5)Na/K ATPaz POZİTİF DEMYELİNİZE
AKSONLAR KOMPLEKS IV
DİSFONKSİYONU İÇERİR
Alıntı yapılan çalışma; sinir uyarıları , Na/K
ATP az enerji bağımlı iken ,kronik lezyonlarda
Na/K ATP az pozitif aksonların
populasyonunu tanımlayarak bu durumun
compleks IV üzerindeki yansımalarını
araştırmıştır.
Kronik inaktif lezyonlarda,toplam
nörofilament reaktivitesi ve rastgele 100 x
görüntüler kullanılıp demyelinize aksonlar
tanımlandığında ;Na/K ATP az 1 pozitif
demyelinize aksonlar dahilinde compleks IV
aktif bileşenlerinin oranı 2.56 ortalama ile 0.0-
8-54 arasında değişmekteydi.
6)COMPLEKS IV İNHİBİSYONU
GLUTAMAT ARACII AKSONAL HASARI
ARTIRMAKTADIR
Daha önce değinildiği gibi,yapılan çalışmada
;nöron kültürleri ;aktivitesini %36’ya düşüren
,compleks IV inhibitörü sodyum azidin
ardından,sodyum azid gib,glutamatın subletal
konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır.İlginç
şekilde,compleks IV inhibisyonu aktivite
azalmasına yol açtı fakat,kısmi enerji
eksikliğinde azaltılmış hızlı aksonal transportu
yansıtabilen APP
immünreaktivitesinde,kontrol grubun kıyasla
anlamlı azalmaya yol açtı.
TARTIŞMA
Alıntı yapılan çalışma; mitokondrial defekt
aksonal dejenerasyona yol açar ve demyelinize
aksonlarda enerji ihtiyacı daha fazladır
hipotezi temelinde ,MS ve kontrol beyin ve
spinal dokularındaki mitokondrial solunum
zincir compleks IV aktivtesi ve mitokondrial
kiteleyi belirlemiştir.
Kronik lezyonlarda,aksonal
dejenerasyon,inflmasyon derecesiyle koreledir
ve bu durum aksonal kayba dönüşür.Aksonal
hasatın patolojik işaretleri;APP gibi
proteinlerinde intrakasonal birikimi ve hızlı
aksonal transport bloğunun belirteci
nörofilament defosforilasyonunu
içerir.Bununla birlikte;güçlü nonfosforile
nörofilament reaktivitesi gösteren morfolojik
olarak intakt kronik demyelinize
aksonlar,SMI31 pozitif kronik demyelinize
aksonlarla kıyaslandığında ,büyük oranda
mitokondrial tüketime bağlı olacak

5. şekilde,compleks IV aktivitesinde anlamlı
azalma göstermiştir.Aksonal transport
bozukluğu sonucu oluşan mitokondrial
tükenme; SOD-1 mutant deney modelinde de
gösterilmiştir
Yapılan çalışma;beyinde ve spinal korda
kronik multipl skleroz lezyonlarının göreceli
inaktif bölgelerinde geniş kronik demyelinize
SMI31 pozitif aksonların yaklaşık
yarısında;geniş myelinli aksonlara kıyasla
mitokondrial kitlede olduğu gibi compleks IV
aktivitesinde de anlamlı artış rapor etmiştir.
Nörofilament fosforilasyonu ve APP birikimi
döneminde compleks IV aktivitesi artmış
kronik demyelinize aksonlarda yapısal
değişikliklerin eksikliği;yukarıda anlatılan
mitokondrial değişikliklerin patolojik proçes
yerine ;demyelinizasyonla ilişkişi potansiyel
adaptif proçes olduğunu gösteriyor ve bu
adaptif değişiklikler mitokondrial kitle ve
aktivitede değişiklikleri içierir.
MS vakalarında beyindeki mylenize
aksonlarda compleks IV aktivitesinde anlamlı
artışın önerdiği şekliyle,lezyondaki lokal
çevresel faktörlerin ;artmış mitokondirial DNA
gibi mitokondriel değişiklerinin major
yönlendiricisi olması muhtemeldir.
Demyelinizasyonla ilişkli compleks IV
aktivitesindeki artış,akson dahilindeki
mitokondriel kitlede artış ile ilişkilidir.
Yapılan çalışmada ,sintafilinin irdelenmesinin
sebebi;karboksi terminal kutruğu ve
mikrotubul bağlanmasıyla,dış mitokondierl
membranı hedefleyerek mitokondriyi
immobilize etmesidir.Bu nedenle sintafilin
aksonlardaki immobil mitokondriyi
tanımlamak için güvenilir bir araçtır ve
sintafilin MS’deki demyelinize akson
dahilinde artmış mitokondrial kitle için destek
sağlar.
Mitokondri;nöroflamentlerin fosforilasyon
durmu ve metabolik aktivitesine bağımlı
olarak;enerji üretim kapasitesi artmış
mitokondrinin daha fazla fosforile
nörofilament bağlaması temeli üzerinde
etkileşir.Akut lezyonlarda hiperfosforile
nörofilament arışı,kronik lezyonlarda artmış
fosforile nörofilament artışı mevcuttur.
Akson dahilinde,mitokondri ve fosforile
nörofilamentler arasındaki etkileşimin
mitokondrial hareketliliği etkileyip
etkilemediği bilinmiyor ancak kronik
lezyonlarda sintafilin artışı;geniş kronik
demyelinize aksonlardaki mitokondrinin
myelinize aksonlara kıyasla göreceli immobil
ve mitokondrial aktivite azalışının ;bu
etkileşimin demyelinize aksonlarda
mitokondrial aktiviteyi kısmen belirlediğini
önermektedir.
İnflamasyon ;mitokondriel disfonksiyonun
potent bir uyarıcısı ve aktive makrofaj ve
mikroglia lezyonda nitrik oksit ve reaktif
oksijen ürünlerinin üreticisidir.Nitrik oksit ve
reaktif oksijen ürünleri compleks IV
aktivitesini irreversible inhibe edebilir,
meydana gelen oksidatif hasar sonucu post-
translasyonel modifikasyonlar mitokondrial
DNA’ya yöneliktir.
Yapılan çalışma;global compleks IV aktivitesi
ve mikroglial makrofaj dansitesi arasında ters
korelasyon;compleks IV disfonksiyonun
primer belirleyicisi olarak mikrogliayı
tanımlar.
1960’larda Hodgkin ve arkadaşları,compleks
IV’ü dinlenme membran potansiyelini koruma
ve Na/K ATP az açısından sodyum akışı için
temel bileşen olarak tanımlamışlardır.NO-
compleks IV inhibitörü-‘in sık bir iletim bloğu
nedeni olduğu gösterilmiştir.Bundan dolayı
mitokondrial solunum zincir kompleks IV sinir
iletimi için bir ihtiyaçtır.Yapılan
çalışma,dinlenme membran potansiyelini
korumanın mümkün olmadığı Na/K ATP az
pozitif kronik demyelinize bir dizi aksonda
kompleks IV aktivitesinin tam eksikliğini
tespit etmiştir.
Enerji kusuru yanı sıra,kalsiyum taşıma
kapasitesindeki işleyiş bozukluğu mitokondrial
solunum zincir defektinin önemli bir
sonucudur.
Multipl Sklerozda inhibitör nöron azalır ve bu
azalış ekstitatör nörotasnmitterleri ve
demyelinize aksondaki ateşlemeleri artırır.

6. SONUÇ
Kompleks IV defekti;Na /K ATP az
aktivitesi,dinlenme membran potansiyeli ve
sinir impulslarını büyük oranda
bozmaktadır;muhtemelen progresiv multipl
sklerozlu hastada kalıcı nörolojik bozukluğun
bir kısmında pay sahibir.
Mitokondriel solunum zincir
aktivitesini;koruma MS’li hastada aksonal
dejenerasyonu önlemek ve fonksiyonunu
geliştirmek açısından teröpatik yarara sahip
olabilir.
YAYHYAYSE