Aplicación de la edición de genomas en los cultivos del CIAT
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"Aplicación de la edición de genomas en los cultivos del CIAT" por Paul Chavarriaga. Líder Plataforma de Transformación y Edición de Genomas del CIAT.
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- 1. Serie de Simposios de DuPont Plant Sciences Octubre 17 y 18 Centro Internacional de Agricultura Tropical-CIAT Palmira-Valle, Colombia
- 2. Generar cambios/mutaciones permanentes y heredables en un sitio específico del ADN. Estos cambios son mediados por los sistemas de reparación del ADN de la maquinaria celular, que posibilitan la inserción, deleción o alteración de las secuencias. Aplicaciones • Función génica: Knock-out • Reemplazo de alelos, inserciones, Knock-in. • Regulación de la expresión génica y epigenética • Gene Drive ¿Qué significa editar un genoma? https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/genomeediting
- 3. KO: Polyphenol oxidase (PPO) - Oxidación KO: granule bound starch synthase GBSSI – Almidón tipo ceroso (Waxy) KO: Genes FAD2: Menos ácidos grasos poliinsaturados, + acumulación de aceite. KI: TALENs, inserción alelo en el gen POLLED
- 4. Prueba de concepto en arroz, var. IR64 122 130 150 Diseño CRISPR Transformación IR-64 Evaluación plantas editadas Flor masculina en plantas editadas IR64WT Fenotipo : Drooping leaf IR64WT
- 5. Eliminación del gen de selección nptII en plantas transgénicas sobreexpresando el gen OsNas. Deficiencia global de Hierro y Zinc Fuente: PSD online database(USDA) and FAOSTAT population database (FAO) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Fe Zn IRON AND ZINC CONCENTRATIONS IN RICE [] initial Conventional Plant breeding Required Transgenic ug/g Concentraciones de Hierro y Zinc en arroz
- 6. Transformar embriones inmaduros de líneas transgénicas OsNAS Regenerar plantas Evaluación molecular Confirmar deleción Delete 2.3 kb using CRISPR/Cas9 Eliminación del gen de selección nptII en plantas transgénicas sobreexpresando el gen OsNas.
- 7. Pérdidas 25-75% en producción Foto por: Michael Gomez Selvaraj. CIAT Phenotyping Platform Validación del gen AGO4 en la resistencia al Virus de la Hoja Blanca en Arroz . Morales y Jennings. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources 2010 5, No. 043
- 8. 1kB p40 p46 p47 p48 p49 p50 p51 p52 p53 p54 p55 p56 p57 p58 p60 p61 n59 n34 n33 fd50 2000H20 RHBV / AGO 4
- 9. Egg Aparatous (EA) Obtención de líneas androestériles Factor de transcripción MYB35 (TDF)
- 10. Fenotipo TDF1 TDF1-P2 90 % del polen es estéril. Para P4, P5, P1 100% del polen es estéril TDF1-P2 TDF1-P4 TDF1-P1 TDF1-P5 IR64 1kB p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12 p13 p14 p15 p16 p17 p18 p19 p20 IR64 H20
- 11. Zhou et al. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42 IR64 Editada única copia Inducción de mutaciones en los promotores de los genes de susceptibilidad a Xanthomonas (SWEET11, 13, 14)
- 12. Callo Embriogénico Friable de la línea CP2-Cl10. Todos los callos presentan tinción azul depués de 30 min en buffer de tinción GUS a 37oC. GUSPlusTM NosT 35S hptII RB LB CP2 NosT cleavage site ATGGCTACTACTAAGCATTTGGCTCTTGCCATCCTTGTCCTCCTTAGCATTGGTATGACCACCAGTGCAAGAACCCTCCTAGATCTGAGGGTAAATTT CTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTA TGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGAACCGACGAACTAGTCTGTA CCCGATCAACACCGAGACCCGTGGC… CEF de la línea CP2-Cl10 editada con CRISPR/Cas9. Ensayo de GUS muestra callo blancos. Target site (yellow); PAM site (green); restriction site (triangle) CRISPR/Cas9 diseñado para editar GUSPlusTM CRISPR/Cas9 diseñado para phytoene desaturase (PDS) pdsKO wt Prueba concepto en Yuca
- 13. Resistencia a herbicidas en Yuca Kaitano et al. 2009; Butterworth et al. 2008; Nweke, 2004
- 14. • Al menos tres homólogos para ALS en Yuca. Target region 1 Target region 2 csr1-1 (Pro197→Ser) csr1-2 (Ser653→Asn) Resistencia a herbicidas en Yuca
- 15. Desarrollo de cassava “WAXY” Methodology Diseño CRISPRs Transformación genética de cassava Producción de callo embriogénico friable (CEF), desarrolado en CIAT, disponible para su transformación (60444). (Estado actual) Contenido de amilosa wt waxy Prueba Iodo Editar el gen GBSSI para obtener almidón libre de amilosa
- 16. • Tiempo de desarrollo de líneas endogámicas (12-15 años) • Alta heterozigosidad. • Difícil sincronización de floración. • Intentos infructuosos de producir DH a partir de cultivos de anteras y micro esporas. Obstáculos en el mejoramiento convencional Edición en Maíz Inducir mutación en el gen ortólogo ZmPLA1 en yuca para generar haploídia Obtención de líneas inductoras haploides en el maíz, generando una sola inserción en el gen ZmPLA1 Diploide Haploide Análisis de similitud para la selección de genes candidatos. Diseño sgRNAs Liu et al. 2017 Inducción de haploidía en yuca
- 17. Transformación genética de P. vulgaris 1 Kb E14.1.1 E14.1.2 E 8.4 pCambia ICA H2O Amplificación gen GUS 1 Kb E14.1.1 E14.1.2 E 8.4 pCambia ICA H2O Amplificación gen marcador hptII
- 18. Prueba concepto con CRISPR/CAS9 FRIJOL Diseño CRISPR (PDS) Metodología Transformación Frijol Evaluación molecular Amplificación región CAS9 gRNA PDS Cas9 HPT Spe E6.1.1 E.6.1.2 E.6.1.3 E6.1.4 E.6.1.5 E.6.1.6 Calima PLASMI H2O FRIJOL Diseño CRISPR Metodología Transformación Frijol Obtención de plantas Edición Proteínas antinutritivas Pruebas moleculares Identificación de Rafinosa y Estaquiosa en frijol
- 19. Perspectivas Establecimiento de nuevas variedades en la plataforma de transformación Genotipos Japónicas Indicas Líneas mejoradas Nipponbare IR64 CT21375F3-43-1 Curinga IRGA 424 CT24019 Caiapo Fedearroz 50 CT24026 Bluebonnet Fedearroz 2000 Nerica 4_T5 Fedearroz 60 Azucena Palmar 18 Llanura 11 SD20A Inia Olimar Supremo 13 Triunfo 960 CT21375 Fedearroz 2000IRGA 424 Bluebonnet Azucena
- 20. Perspectivas Diseño y Transformación con CRISPRs para: - Aumento del número de granos/panícula - Reducción en la absorción de Cd & As Inez et al. Enriching rice with Zn and Fe while minimizing Cd risk. Frontiers in Plant Science. 2015 Chen et al.Arsenic transport in rice and biological solutions to reduce arsenic risk from rice. Frontiers in Plant Science. 2017
- 21. Perspectivas Obtención de plantas editadas a partir de protoplastos Fotos & Figs : Tiew TWY et al, Frontiers in Plant Science 6, August 2015. https://www.mirusbio.com/applications/genome-editing-using-crispr-cas/rnp-delivery CIAT Ribonucleo-Proteína Planta Editada/Mutada No-ADN No transgenes No selección PEG
- 22. Detección de acidos nucleicos mediante CRISPR-Cas13a/C2c2 Perspectivas J. S. Gootenberg et al., Science 10.1126/science.aam9321 (2017). SHERLOK(Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unlocking)
Notas del editor
- Generar un cambio planeado. Permanente, y se hereda, en un sitio específico del ADN, mediado por los sistemas de reparación del ADN de la maquinaria celular. Knock-out: Silenciar un gen. Impedir que una proteína se exprese. Estable en el tiempo.
- La endogamia se refiere al cruzamiento entre individuos de una misma raza dentro de una población aislada, tanto geográfica, como genéticamente. La haploidía es un estado de la célula en el cual su núcleo no tiene dotación cromosómica doble, es decir, tiene sólo un juego de cromosomas. E
- Recently,ithasbeendemonstratedthatthe OsNRAMP5 gene in riceactsasamajortransporterofCdandMnintheroots (Ishikawaetal.,2012; Sasaki etal.,2012). Expressionanalysis showedthatitspresencewasrestrictedtoroots,aswellasintis- sues aroundthexylem(Ishimaruetal.,2012; Sasaki etal.,2012). Inaddition,extensiveanalysisofsilencing,insertionknock-out plants, andion-beamirradiationmutantsconfirmedtherole of OsNRAMP5 in reducingtheCdaccumulationbothinstraw and ingrainstonegligiblelevels,evenwhengrowninCd- contaminatedpaddyfields(Ishikawaetal.,2012; Ishimaruetal., 2012; Sasaki etal.,2012). Usingadifferentapproach,hydro- ponic andsoilcultureexperimentssuggestedroot-to-shootCd translocationviathexylemasthemajorphysiologicalprocess for determininggrainCdaccumulationinrice(Uraguchietal., 2009). AnalysisofmappingpopulationsforidentificationofQTLs relatedtoCdaccumulationinricegrainsindicatedthepres- enceofageneticlocusinchromosome7
- otras proteínas Cas que son capaces de cortar moléculas de ARN (en lugar de ADN), dirigidas también por guías de ARN. Es el caso de la proteina Cas inicialmente denominada C2c2(hoy renombrada como Cas13a), que fue descrita hace menos de un año por el propio equipo de Feng Zhang, en colaboración con otros investigadores. La proteína Cas13a es por lo tanto una endonucleasa de ARN dirigida por ARN. En su momento ya se pensó que la Cas13a podría dar mucho juego, sobre todo en aplicaciones de análisis de la expresión génica, al ir dirigida su actividad hacia ARN y no hacia ADN. Muy pronto Feng Zhang y sus colaboradores se dieron cuenta de una actividad colateral, inesperada, de corte inespecífico de cualquier ARN, que aparecía asociada a la proteína Cas13a tras activarse, es decir, tras acomplejarse con la guía de ARN y tras encontrar su molécula de ARN complementaria. En otras palabras, cuando la proteina Cas13a unida a una guía de ARN determinada encuentra su secuencia de ARN complementaria, no solo empieza a cortar esta secuencia sino cualquier otra secuencia de ARN que encuentre, de forma inespecífica. Esto es, sin duda, un problema importante y una limitación para el posible uso de Cas13a en edición genética. Sin embargo, ha resultado ser una oportunidad sorprendente para convertir el sistema Cas13a en un procedimiento diagnóstico, denominado SHERLOCK, gracias a la imaginación de los investigadores del BROAD. Mezclando en el tubo de ensayo las muestras a analizar con pequeñas moléculas de ARN asociadas a compuestos fluorescentes inactivos, que solamente empiezan a brillar cuando se corta el ARN, han conseguido ligar la identificación de secuencias específicas de ARN a una señal fluorescente, fácilmente detectable. Si en la muestra problema existen secuencias de ARN complementarias a la guía de ARN de la proteína Cas13a esta empezará a cortar todos los ARN de la mezcla, incluidos los que desatarán una señal fluorescente tras ser degradados. Esta es una técnica sorprendentemente sencilla, y poderosa. a especificidad de la tecnología SHERLOCK reside en la propia proteína Cas13a, capaz de discriminar entre dos secuencias de ARN que se diferencien solamente en un nucleótido, en una letra. Cas13a solamente se activa si la guía de ARN encuentra exactamente su secuencia complementaria. Para aumentar la sensibilidad del proceso los investigadores someten a la muestra inicial a una serie de amplificaciones y transformaciones de ADN a ARN, usando la enzima T7 RNA polimerasa, la cual funciona a temperatura corporal, es decir, a +37 grados (simplemente manteniendo la muestra entre nuestros dedos), sin necesidad de requerir equipos termocicladores como los que se usan habitualmente en las técnicas de detección por PCR. Esto es una ventaja obvia si se piensa convertir esta tecnología en kits de detección de patógenos virales en territorios en los que difícilmente puede encontrarse una máquina de PCR, como algunas zonas de África, por ejemplo. Los investigadores del BROAD demuestran el uso de SHERLOCK detectando la presencia del virus Zika o del Dengue (o ADN de células tumorales) a partir de muestras de sangre de pacientes, con una sensibilidad atto-molar, es decir, de 10exp(-18), capaces de detectar una molécula de ARN viral entre un trillón (un millón de billones) de moléculas de ARN. Un artículo de Stat compara esta sensibilidad a la de ser capaz de detectar agua salada tras disolver una pizca de sal en el Lago Superior de EEUU, el mayor de los grandes lagos de agua dulce en NorteAmérica, con un volumen de 12,000 Km3 de agua (doce mil billones de litros de agua).